Urodził się w rzymskiej rodzinie Julia. Nie jest znana data jego urodzin. Biskupem Rzymu został 12 maja 254 roku. Za jego pontyfikatu udało się uniknąć prześladowań chrześcijan. Rozegrał natomiast spór dotyczący chrztu apostatów i heretyków. Wielu biskupów, zwłaszcza z Afryki Północnej, Syrii i Azji Mniejszej, w tym biskup Kartaginy Cyprian, uważali, że przed powrotem do Kościoła należy dokonać powtórnego chrztu. Takie stanowisko zajął synod kartagiński (w 255 roku). O czym poinformował Stefana I biskup Cyprian, który przesłał dokumentację synodu do Rzymu. Stefan sprzeciwił się takim praktykom. Wspierany przez tradycję rzymską, aleksandryjską i jerozolimską uważał, że w celu pojednania z Kościołem heretycy i schizmatycy nie potrzebują ponownego chrztu. Muszą jednak otrzymać rozgrzeszenie przez nałożenie rąk. Cyprian próbował uzyskać wsparcie synodów lokalnych, lecz Stefan I odmówił stanowczo dyskusji na ten temat. Nie przyjął delegacji afrykańskiej, która w tej sprawie przybyła do Rzymu. Opornym zagroził ekskomuniką. Nie pomogła także próba mediacji biskupa Dionizego z Aleksandrii. Groziło to kolejnym podziałem w Kościele. Rozłamowi zapobiegła śmierć Stefana I i Cypriana. Rozpatrując konflikt między biskupami należy mieć świadomość, że ówczesny Kościół nie przybrał jeszcze hierarchicznej struktury. Tworzył swoistą federację lokalnych kościołów, wśród których coraz większą rolę odgrywał biskup Rzymu.

Kolejny spór wybuchł na tle apostazji dwóch biskupów z Półwyspu Pirenejskiego. Stefan zrehabilitował biskupów. W odpowiedzi Cyprian, na prośbę kościołów hiszpańskich, zwołał synod biskupów afrykańskich i wydał list potwierdzający złożenie biskupów z urzędu z powodu apostazji. Kolejnym spornym problemem było postępowanie biskupa Marcjana z Arles, który był zwolennikiem poglądów Nowacjana. Odmawiał on rozgrzeszenia chrześcijańskim apostatom, nawet w obliczu śmierci. Cyprian wezwał Stefana do usunięcia Marcjana z urzędu. Pomimo próśb wiernych w tej sprawie, Stefan nie podjął jednak żadnych kroków.

Stefan I zmarł 2 sierpnia 257 roku. W kalendarzu liturgicznym był wspominany w dniu swojej śmierci.